1. Récolte d’échantillons pour l’extraction du polyphosphate
- Cultiver des bactéries dans les conditions d’intérêt pour déterminer la teneur en polyP. Pour ce protocole, cultivez Lactobacillus reuteri pendant la nuit à 37 °C sans agiter dans un milieu d’induction d’enzymes maliques (MEI) sans cystéine (MEI-C).
- Récoltez suffisamment de cellules par centrifugation dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL pour obtenir un total de 50 à 100 μg de protéines cellulaires (voir l’étape 3 ci-dessous). Pour E. coli, il s’agit de 1 mL d’une culture en phase logarithmique à un A600 de 0,2 à 0,4. Pour L. reuteri, il s’agit de 1 mL d’une culture de nuit. Ajustez au besoin pour d’autres espèces d’intérêt.
- Retirez complètement le surnageant des pastilles cellulaires.
- Remettre les pastilles cellulaires en suspension dans 250 μL de tampon de lyse GITC (isothiocyanate de guanidine 4 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7) et lyser par incubation à 95 °C pendant 10 min. Conserver les lysats à -80 °C.
REMARQUE : Respecter le temps de lyse, car une incubation prolongée à haute température peut entraîner la dégradation du polyP par hydrolyse. Les lysats peuvent être conservés indéfiniment à -80 °C.
ATTENTION : L’isothiocyanate de guanidine est un sel chaotrope qui doit être manipulé avec des gants et éliminé comme déchet dangereux.
2. Mesure de la teneur en protéines des lysats cellulaires Préparez des
- étalons d’albumine sérique bovine (BSA) contenant 0, 0,1, 0,2 et 0,4 mg mL-1 de BSA dans le tampon de lyse GITC.
REMARQUE : Il est important de faire les étalons BSA dans GITC, car GITC influence le développement de la couleur du test Bradford. Les étalons BSA peuvent être conservés indéfiniment à -20 °C. - Aliquote 5 μL de lysats cellulaires décongelés et bien mélangés et d’étalons BSA pour séparer les puits dans une plaque transparente à 96 puits.
- Ajouter 195 μL de réactif Bradford dans chaque puits et mesurer l’absorbance à 595 nm (A595) dans un lecteur de plaque (voir le tableau des matériaux).
- Calculez la quantité de protéines dans chaque puits par rapport à la courbe standard BSA, à l’aide de la formule y = mx + b, où y est A595, x est μg de BSA, m est la pente de la courbe standard et b est l’ordonnée à l’origine de la courbe standard. Multipliez la valeur résultante par 0,05 pour déterminer le mg total de protéines dans chaque échantillon.
3. Extraction du polyphosphate
- Ajouter 250 μL d’éthanol à 95 % à chaque échantillon lysé par GITC et à mélanger avec vortex.
- Appliquer ce mélange sur une colonne de centrifugation à membrane de silice et centrifuger pendant 30 s à 16 100 x g.
- Jeter le liquide à écoulement, puis ajouter 750 μL de 5 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM de NaCl, 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 50 % d’éthanol et centrifuger pendant 30 s à 16 100 x g.
- Jeter le flux continu et centrifuger pendant 2 min à 16 100 x g.
- Placez la colonne dans un tube microfuge propre de 1,5 mL et ajoutez 150 μL de Tris-HCl 50 mM (pH 8).
- Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis éluer le polyP par centrifugation pendant 2 min à 8 000 x g.
REMARQUE : Si vous le souhaitez, les éluats peuvent être conservés à -20 °C pendant au moins 1 semaine.
4. Digestion du polyphosphate
- Préparez des étalons contenant 0, 5, 50 ou 200 μM de phosphate de potassium dans 50 mM de Tris-HCl (pH 8).
REMARQUE : Les étalons de phosphate de potassium peuvent être conservés indéfiniment à température ambiante. - Aliquote 100 μL de chaque étalon de phosphate et des échantillons de polyP extraits dans des puits séparés d’une plaque transparente de 96 puits.
- Préparez un mélange maître contenant (par échantillon) : 30 μL de tampon de réaction 5x ScPPX (100 mM de Tris-HCl, 25 mM de MgCl2, 250 mM d’acétate d’ammonium, pH 7,5)13, 19 μL de H2O et 1 μL de ScPPX purifié (1 mg mL-1).
- Ajouter 50 μL du mélange principal dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Incuber pendant 15 min à 37 °C.
REMARQUE : Si vous le souhaitez, les échantillons de polyP digérés peuvent être conservés indéfiniment à -20 °C.
5. Détection du phosphate libre
- Préparez la base de la solution de détection en dissolvant 0,185 g de tartrate d’antimoine et de potassium dans 200 mL d’eau, en ajoutant 150 mL de 4 N H2SO4, puis en ajoutant 1,49 g d’heptamolybdate d’ammonium. Remuer pour dissoudre, puis porter à un volume final de 456 ml. Filtrez la solution pour éliminer les particules et conservez-la à l’abri de la lumière à 4 °C jusqu’à 1 mois.
- Préparez une solution mère d’acide ascorbique 1 M. Conserver à l’abri de la lumière à 4 °C jusqu’à 1 mois.
- Préparez chaque jour une nouvelle quantité de solution de détection en mélangeant 9,12 mL de base de solution de détection avec 0,88 mL d’acide ascorbique 1M. Laissez la solution de détection revenir à température ambiante avant utilisation.
- Ajouter 50 μL de solution de détection à chaque échantillon et étalon dans la plaque à 96 puits et incuber à température ambiante pendant environ 2 min pour permettre le développement de la couleur.
- Mesurez l’absorbance à 882 nm à l’aide d’un lecteur de plaques et calculez la concentration en phosphate de chaque échantillon par rapport à la courbe standard du phosphate de potassium.
ATTENTION : La solution de détection contient des sels toxiques et des acides forts. Portez des gants et traitez l’excès de solution comme un déchet toxique.
6. Calcul de la teneur en polyphosphate cellulaire
- Convertissez les concentrations de phosphate déterminées à l’étape 5.5 en nanomoles de phosphate dérivé du polyP dans chaque lysat cellulaire entier selon la formule suivante :
nmol polyP = 1,5 x (μM phosphate / 10)
REMARQUE : La méthode standard basée sur la courbe à l’étape 5 détermine la concentration de phosphate (en μM) dans chaque échantillon de 100 μL de polyP aliquote à l’étape 4.2. Pour convertir cette concentration en nombre de nmol, on divise 100 μL par 106 pour obtenir un volume en L, multiplié par la concentration (μmol L-1), puis multiplié par 1 000 (le nombre de nmol dans un μmol). Cela revient à diviser la concentration par 10. Le volume total de l’extrait préparé à l’étape 3 est de 150 μL, il est donc nécessaire de multiplier la valeur résultante par 1,5 pour calculer le nmol de phosphate présent dans l’ensemble de l’extrait. - Normaliser la teneur en polyP cellulaire en protéine cellulaire totale en divisant le polyP nmol par le mg de protéine totale dans chaque échantillon déterminé à l’étape 1.4. Les niveaux de polyP sont exprimés en termes de concentration de phosphate libre dérivé de polyP individuel.
REMARQUE : Dans certains cas, la quantité de phosphate dérivé du polyP présente dans un échantillon peut se situer en dehors de la plage linéaire de la courbe standard de phosphate. Si les niveaux de polyP sont très élevés, l’éluat contenant du polyP en excès de l’étape 3.6 peut être dilué à l’échelle 1:10 ou 1:100, selon les besoins, puis mesuré à nouveau comme décrit aux étapes 4 à 6.
